Technique de Southern blot

C’est la méthode d’analyse de l’ADN imaginée par Southern en 1975 pour visualiser les gènes ou toute séquence d’un ADN génomique, par une hybridation avec une sonde, marquée et spécifique, avec des fragments de restriction d’ADN, préalablement séparés par électrophorèse, dénaturés et transférés sur une membrane.

Le processus est le suivant:

· L’ADN génomique est d’abord fragmenté par une enzyme de restriction appropriée

· Les fragments sont ensuite séparés par électrophorèse sur gel d’agarose,

· L’ADN est dénaturé in situ par une solution de soude,

· L’ADN dénaturé (simple brin) est transféré par capillarité sur un support solide (filtre de nitrocellulose ou nylon). Les membranes de nylon sont les plus utilisées car par un traitement au UV (254 nm), on forme des liaisons covalentes entre le DNA et le nylon de sorte que le support peut être utilisé plusieurs fois avec d’autres sondes.

· Le support solide est hybridé avec une sonde mono-brin marquée à faible stringence puis lavé

· Le ou les fragments reconnus par la sonde sont révélés par la technique de l’autoradiographie.

Cette technique permet :

· L’établissement des cartes de restriction : Les enzymes de restriction coupent l’ADN au niveau de séquences bien définies. Il est donc facile d’établir une carte de restriction par cette méthode.

· La mise en évidence de pseudo-gènes et de gènes apparentés : Une sonde suffisamment longue peut s’hybrider avec des séquences non totalement complémentaire : pseudogènes, gènes d’une même famille ou gènes homologues d’une espèce différente. Ces gènes sont mis en évidence en fonction des conditions d’hybridation (stringence).

· Les mutations par délétions : Cette technique permettant de visualiser un gène, il est possible de mettre en évidence une délétion pourvue qu’elle ne soit pas très grande.

· La détection de mutation ponctuelle : Le remplacement d’une base par une autre peut se traduire par la disparition ou la création de sites de coupures pour une enzyme de restriction donnée. Cette variation des sites de coupure se traduit par la disparition d’une ou de deux bandes (suivant la longueur de la sonde utilisée) et l’apparition d’une bande de taille supérieur dont la longueur est égale à la somme des longueurs des deux bandes disparues. La création d’un nouveau site de coupure donne le résultat contraire.