Extraction et purification des acides nucléiques

I-    Extraction de l’ADN:

Toutes les méthodes biochimiques qui permettent d’extraire l’ADN dans les différents tissus peuvent être utilisées en fonction des espèces, et en tenant compte de la structure anatomique des cellules. Nous prendrons comme exemple, les cellules eucaryotes humaines, en l’occurrence les cellules sanguines qui sont très accessibles. Pour ce qui concerne le génome humain comme pour tous les mammifères, les leucocytes sanguins constituent une source simple de DNA pour les études de biologie moléculaire.

Un prélèvement de 5 à 10 ml de sang recueilli sur un anticoagulant comme l'EDTA, permet d’obtenir quelques centaines de microgrammes de DNA sous la forme de fragments de taille supérieure à 20 kbases. Cette quantité est suffisante pour entreprendre une expérience d’application en génie génétique.

1. La lyse des cellules eucaryotes:

La lyse des cellules sanguines met en jeu l’intervention de détergents ioniques qui désorganisent la double couche de phospholipides des membranes cellulaires. Le sang fraîchement recueilli (avec un anticoagulant comme l’EDTA) ou décongelé est vigoureusement mélangé à une solution hypotonique pour faire éclater les hématies dépourvues de noyaux. Les leucocytes sont alors récupérés par centrifugation suivie d’un lavage avec la même solution hypotonique. Ils sont ensuite traités par un mélange de détergent, comme le SDS (Sodium DodécylSulfate) qui permet de désagréger les membranes cellulaires et de libérer les contenus cytoplasmiques et nucléaires. En biochimie classique et pour d’autres applications, il faut d’abord séparer les noyaux du contenu cytoplasmique et de ces organites cellulaires. Un traitement par la protéinase K (une protéase) permet de libérer le DNA nucléaire en digérant les histones qui lui sont associées dans les chromosomes eucaryotes. L'élimination des protéines non digérées et des lipides se réalise par des précipitions et des extractions sélectives. Le mélange phénol-chloroforme permet de dénaturer les protéines car non miscible à l’eau et de densité supérieure à cette dernière. Les acides nucléiques n'y sont pas non plus solubles et restent dans le surnageant aqueux. Pour les tissus, il est conseillé de les désagréger par les techniques courantes de biochimie comme le broyage ou les ultrasons. Une congélation préalable permet de transformer les tissus en une masse solide qui se prête alors à un concassage par les techniques courantes de broyage. L’extraction et la purification suivent alors le même protocole.

2. L’ADN des procaryotes:

Escherischia coli est la bactérie la plus utilisée pour les analyses en biologie moléculaire. La lyse cellulaire utilise une enzyme : le lysozyme qui permet de dégrader la membrane cellulaire. La purification suit le même schéma que pour celle de l’ADN des eucaryotes.

3. L’extraction de l’ADN par le mélange phénol / chloroforme:

Le mélange phénol-chloroforme non miscible à l’eau permet de transférer les protéines dans la phase organique alors que les acides nucléiques restent dans la phase aqueuse. La phase aqueuse résultante peut subir plusieurs extractions par un mélange chloroforme-éther pour éliminer les peptides restants, les traces de phénol et des composés organiques qui y sont solubles.

 Les acides nucléiques sont alors à récupérer de la phase aqueuse par des précipitations à l’alcool éthylique ou à l’isopropanol. On obtient alors les acides nucléiques sous la forme de fibres solides que l’on récupère par centrifugation. Pour des études biochimiques fines de structure, il convient de procéder à d’autres purifications. Pour les analyses génétiques (application des diagnostics de routine), le DNA obtenu est de qualité suffisante.

L'élimination de l'ARN peut être effectuée à la fin ou avant l'étape phénolique. Pour cela, on utilise une RNAase pure ou "DNAase free", c'est à dire, dépourvue d'activité DNAase.

L’ADN récupéré sous forme de fibres peut être conservé sous la forme solide pendant des temps très longs. Il peut aussi être re-dissout dans un tampon stérile.

L’extraction au phénol-chloroforme nécessite beaucoup de temps, l’utilisation de produits chimiques dangereux et plusieurs transferts de l’échantillon, ce qui l’expose à des risques de contamination.

 

figure: extraction phénolique

4- Papier FTA :

Le papier FTA est une chimie brevetée de la société Whatman. Cette chimie sur matrice de cellulose permet d'une part la lyse des membranes des cellules déposées et de leurs organelles suivie du largage des acides nucléiques qui seront enchâssés et protégés dans les fibres du support. D'autre part, elle inactive les phages, bactéries et virus rendant ainsi inertes (pour le manipulateur et pour les acides nucléiques) les échantillons collectés. Une fois secs, les acides nucléiques sont protégés de la dégradation enzymatique, microbienne, oxydative ou par les radicaux libres, et peuvent être conservés durant plusieurs années à température ambiante .

Un prélèvement sur carte FTA consiste en la découpe, à l'aide d'un emporte-pièce, d'une rondelle (punch) de 1,2 mm de diamètre imprégnée de sang (ou de salive) séché. Le punch est lavé plusieurs fois puis séché à température ambiante et conservé transitoirement à 4°C ou utilisé directement en PCR.

5. Extraction différentielle:

L’extraction différentielle est une version modifiée de l’extraction organique; elle sépare les cellules épithéliales des spermatozoïdes dans le cas des agressions sexuelles, ce qui permet de différencier le profil masculin du profil féminin. Cette méthode implique la lyse préférentielle des cellules épithéliale par une incubation dans un mélange SDS/protéinase K, puis les cellules spermatiques sont lysées par traitement avec le mélange SDS/Protéinase K/dithiothréitol (DTT). Le DTT permet de rompre les ponts dissulfures présents dans la membrane nucléaire des spermatozoïdes. La différence majeure avec la méthode d'extraction organique est l’incubation initiale dans le mélange SDS/protéinase K sans la présence du DTT

6- Extraction des ARN:

Les ARN sont plus difficiles à étudier parce qu’ils sont très sensibles aux ribonucléases (RNase A) qui sont très actives et présentes même sur les doigts du manipulateur. Elles peuvent résister à un traitement à 90°C pendant une heure. Il faut donc des conditions de stérilité parfaite pour travailler avec ces acides nucléiques. l’extraction, les tissus ou les cellules sont homogénéisés dans un tampon acétate contenant :

- Un détergent puissant (SDS ou sarcosyl)

- Un agent dissociant (thiocyanate ou guanidine)

- Un agent réducteur (DTT ou 2-mercaptoéthanol)

           Ce type de tampon permet d’inhiber les RNases endogènes, de dénaturer les acides nucléiques et de dissocier les protéines. Après une centrifugation pour éliminer les débris cellulaires, les RNA sont extraits suivant plusieurs techniques. La technique par précipitation différentielle du RNA et du DNA en fonction du pH et de la concentration en éthanol donne de très bons rendements. On peut également utiliser l’ultracentrifugation. Le culot est récupéré, lavé avec le tampon acétate et précipité à l’éthanol. Il peut se conserver congelé à –70°C pendant un an.

Purification de l’ADN

Purification par l’éthanol

-                      La purification d’une solution d’ADN se fait le plus souvent par précipitations répétées dans l’alcool.

-                      Une solution d’ADN, portée à haute force ionique par addition de NaCl 3 M (1/10 du volume), est additionnée d’un large excès d’éthanol absolu à -20°C. Au bout de quelques minutes au maximum, on voit apparaître un précipité blanchâtre, translucide et filamenteux (la « méduse ») constitué de longs filaments d’ADN précipité.

-                       On recueille ce précipité par centrifugation à 10000 g pendant un quart d’heure environ. Pour laver l’ADN on resuspend le précipité dans de l’éthanol à 75 % toujours à -20°C. puis on centrifuge à nouveau. Le culot de cette dernière centrifugation est égoutté, puis séché sous vide.

-         On peut conserver l’ADN à sec ou le redissoudre immédiatement soit dans de l’eau pure stérile, soit dans un tampon Tris-EDTA.

-         Purification du RNA-poly(A)

 • Parmi les acides ribonucléiques extraits des cellules, la classe la plus étudiée est celle des  ARN messagers. Ils se caractérisent par la présence du côté 3’-terminal d’une longue queue poly(A) synthétisée à la phase post-transcriptionnelle.

• On utilisera une chromatographie d’affinité entre cette queue poly(A) et une colonne dont la  phase fixe est pourvue de fragments d’oligo(dT) de quelques dizaines de nucléotides qui peuvent

s’hybrider avec les RNA poly(A).

• Après avoir lavé la colonne en milieu alcalin (potasse), on charge les RNA totaux à haute force

ionique (KCl 0,5 M) puis on rince la colonne avec du KCl 0,1 M en surveillant l’absorbance de l’éluat à 260 nm pour s’assurer de l’élimination des RNA non retenus par la colonne (rRNA, tRNA,... ). Enfin, on élue la fraction retenue par la colonne en abaissant la concentration de KCl à 0,01 M et en élevant la température.

• Un micro essai avec la reverse transcriptase permet de s’assurer de la qualité de ce RNA poly(A) comme matrice pour la synthèse de cDNA.

II. CONTRÔLE DE LA PURETÉ DE L'ADN EXTRAIT:

Le maximum d'absorption des acides nucléiques se situe à 260 nm. Les protéines, principaux contaminant des préparations absorbent aussi à 260 nm, mais avec maximum d'absorption qui se situe vers 280 nm à cause des acides aminés aromatiques.

 Le rapport R= A260nm / A280nm constitue alors un bon moyen pour apprécier une éventuelle contamination de la préparation d'ADN par les protéines ou par les RNA. Une contamination par les ARN se traduit par une augmentation du rapport R.

Les ARN étant en simple brin, le coefficient moyen d’absorption d’un nucléotide est supérieur à celui du même nucléotide dans la double hélice à cause de l’hypochromisme.

 R = A260nm/A280nm

 ADN pur:                                                1,8 < R < 2

 ADN contaminé par les protéines:                   R < 1,7

 ADN contaminé par les ARN:                          R > 2

          En absence d'impuretés l'absorbance de la solution d’ADN à 320 nm doit être autour de zéro.

III: QUANTIFICATION DE L'ADN:

         a. - Dosage colorimétrique de l'ADN:

Il est basé sur la réaction spécifique des 2-désoxypentoses avec la diphénylamine. En milieu acide à chaud, le 2-désoxyribose des nucléotides puriques peut être libérés et former un composé bleu dont le maximum d'absorption se situe à 595 nm. C’est la méthode classique pour mesurer des quantités importantes de DNA (de l’ordre de quelques milligrammes).

          b: Dosage par absorption U.V. de la concentration en ADN:

A 260 avec un trajet optique de 1 cm, une unité d'absorbance correspond à une concentration d’ADN double brin de 50 µg / ml. Une unité d’absorbance correspond à 25 µg/ml de RNA ou d’ADN simple brin.

Malheureusement, cette méthode est peu sensible pour manipuler des concentrations d'ADN inférieures à 250 hg/ml

c. Dosage de l'ADN par fluorescence en présence de BET:                                        Le Bromure d'Ethidium (BET) interagit avec l'ADN en s’y intercalant et une fois intercalé, le rendement de fluorescence du colorant devient cent fois plus important. Le principe de la quantification consiste à comparer à l’œil nu (estimation), ou mieux après photographie, l'intensité de la fluorescence émise par l'ADN sur un gel d’électrophorèse. La quantification exacte consiste alors à établir une courbe d’étalonnage donnant l’intensité de fluorescence d’une solution de BET à laquelle on ajoute des quantités croissantes de DNA de concentration connue. (Gamme d'étalonnage). Par cette méthode on peut déceler des quantités de DNA de l’ordre de 50 hg/ml.

d. Dosage fluorimétrique classique de l'ADN:

On utilise un spectrofluorimètre pour mesurer l'intensité de la fluorescence d'une solution d'ADN en présence d'un excès de BET. On compare ensuite les valeurs de ces intensités avec celle d'une solution d'ADN standard (courbe standard). Le BET peut être remplacé par un autre colorant pour augmenter la sensibilité de la mesure. Cette méthode permet de mesurer des quantités d’ADN de l’ordre de quelques picogrammes.

e- Dosage par la PCR temps réel :

La PCR en temps réel permet de mesurer l’accumulation du produit de PCR à chaque cycle au cours de la réaction d’amplification. Le principe est d’utiliser un marquage fluorescent du produit de PCR. L’appareil de PCR en temps réel n’est autre qu’un thermocycleur classique sur lequel vient s’ajouter un détecteur de fluorescence, il mesure l’intensité de la fluorescence en fonction du nombre de cycles (cette technique sera détaillée ultérieurement).