hybridations moléculaires

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Etudes de toxicologie conventionnelle : essais de toxicité chez l’animal

1-Introduction

            Il est évident que les données toxicologiques de première importance sont celles déduites suite à une exposition humaine. Ceci permet d’éviter les difficultés rencontrées lors de la généralisation (extrapolation), à l’homme, des conclusions tirées à partir d’études sur les animaux( exemple du thalidomide).

            Cependant, les essais sur les animaux permettent de prédire l’innocuité/toxicité des substances et de définir des niveaux d’exposition acceptables pour l’homme. En fait, une part importante des connaissances sur la toxicité des xénobiotiques provient des études aux cours desquelles des animaux d’espèces variées reçoivent plusieurs doses d’un même toxique.

            Il existe trois catégories d’essais de toxicité qui diffèrent en fonction de la durée d’exposition : les essais de toxicité aiguë, les essais de toxicité sub-chronique (et/ou sub-aiguë) et les essais de toxicité chronique(à long terme).

2-Essais de toxicité aiguë 

            La plupart de ces études sont programmées pour déterminer la dose létale médiane(DL₅₀) du toxique,définie comme « l’estimation statistique d’une dose unique de produit supposée tuer 50% des animaux ».

            Ces études permettent de déterminer l’effet spécifique au produit, l’organe cible et de fournir des bases pour déterminer les doses à utiliser dans les études à long terme.

Dispositif expérimental pour la détermination de la DL₅₀

Sélection de l’espèce animal

-Ce sont généralement les rats et les souris qui sont sectionnées : disponibles à bon prix, obtention et manipulation facile, abondance des données toxicologiques qui facilitent la comparaison des toxicités.

-Une espèce autre qu’un rongeur est quelquefois nécessaire, lorsque les valeurs de la DL₅₀ sont très différentes entre les rats et les souris. Ou lorsque le schéma métabolique et différent de celui observé chez l’homme.

-La détermination est faite préférentiellement sur des animaux des deux sexes, jeunes et âgés.

Voie d’administration  

-Généralement, la même voie de l’exposition humaine. L’administration orale par gavage est la plus fréquente.

-Voie cutanée et respiratoire, pour les cas où l’exposition humaine est faite par ces voies, mais également en toxicologie professionnelle.

-La voie parentérale sert à tester la toxicité des médicaments parentériques.

Doses et nombre d’animaux  

-Pour déterminer correctement une DL₅₀ il est indispensable de sélectionner une dose qui tuera environ la moitié des animaux, une dose qui en tuera plus de la moitié(mais moins de 90%) et une dose qui en tuera moins de la moitié(mais de préférence plus de 10%). Quatre doses ou plus sont sélectionnées pour qu’au moins trois d’entre elles soient dans cette gamme.

-La précision de la DL₅₀ est améliorée en augmentant le nombre d’animaux par dose et en diminuant le rapport entre deux doses successives. La plupart des tests utilisent entre 40 à 50 animaux pour un test de mortalité et des rapports de 1,2 à 1,5.

Facteurs environnementaux

-Le conditionnement peu affecter la DL₅₀ : l’isoprotérenol a une DL₅₀ de moins de 50mg/kg chez des rats encages individuelles et d’environ 800mg/kg chez des rats par groupes de 10.

-Le type de cage (grillagée ou en plastique) et le matériau de litière peuvent aussi modifier la DL₅₀.

-La température peut modifier la toxicité : la toxicité de la strychnine, de la nicotine et de l’atropine est augmentée chez l’animal exposé au froid ; celle du malathion et du sarin(pesticide organophosphorés) est augmentée par la l’hypothermie, tandis que celle du parathion (autre organophosphoré) est réduite.

-L’augmentation de l’humidité relative peut être une cause d’augmentation de la toxicité aiguë, et donc de diminution de la DL₅₀.

Examens

-Après administration du toxique aux animaux, l’heure de la mort et le nombre de morts doivent être notés pour déterminer la DL₅₀.

-Il est important que les signes de toxicité soient aussi notés, exemple : pour l’appareil digestif ( nausée, diarrhées,…. ), pour plus de détailles voir le tableau( annexes) : relation entre organes(ou système) et signes cliniques d’intoxication.

-La période d’observation doit être suffisamment longue pour que les effets retardés- y compris la mort- ne passent pas inaperçus. Cette période est généralement de 7à14 jours, mais peut être plus longue.

-Des examens macroscopiques doivent être faits sur tous les animaux morts et au moins quelques survivants, particulièrement ceux qui présentent des signes de morbidité (pathologiques) à la fin des essais.

-L’autopsie est en mesure de fournir des informations utiles sur les organes cibles. Des examens histologiques d’organes sélectionnés peuvent compléter ces information.

Interprétation des données : Relation dose-réponse(effet)

Quand la mortalité est représentée graphiquement en fonction du logarithme de la dose, on obtient une courbe en S(sigmoïde).

Utilisation des DL₅₀ et des signes de toxicité

Ces données sont utilisables à plusieurs fins :

-Classification des produits chimiques selon leurs toxicités relatives(DL₅₀).

-Programmation des études subaiguë et chroniques sur les animaux.

3-Essais de toxicité subaigue (subchronique)

Dispositif expérimental pour la détermination de la DL₅₀

Sélection de l’espèce animal

-L’idéal serait que les espèces choisies biotransforment le toxique de la même façon que l’homme.

- Souvent le rat et le chien.

Espèces et nombre d’animaux  

-On utilise un nombre égale d’animaux de chaque sexe, pour chaque dose, pour le témoin généralement 10à30 rat. Ou un nombre plus réduit pour les chiens.

Voie d’administration

Doit refléter l’exposition humaine. Habituellement la voie orale.

Durée et doses

-Choisir 3 doses : une dose suffisamment élevée pour produire des signes de toxicité sans tuer tous les animaux. une dose faible sans effet toxique prévisible et une dose intermédiaire.

-Les doses sont sélectionnées sur la base  des résultats d’études de toxicité aiguë (DL₅₀ et la pente de la droite dose –réponse).

-La durée de ces études est en général de 90 jours chez le rat, et jusqu’à 6 mois ,voire 1 ou 2 ans chez le chien.

Examens

-Poids du corps et consommation alimentaire.

-Observation générale : concerne l’aspect, le comportement, et toutes les anomalies visibles. Les animaux morts ou moribonds (mourants) sont soumis à des examens macroscopiques et microscopiques.

-Examens de laboratoire : hématologiques, biochimiques, chimies des urines,…

-Examens post mortem(après la mort) : tous les animaux morts ou mourant soumis à des autopsies, examens histologiques, poids des différents organes.

Evaluation

Sur la base des données obtenues lors des différents examens réalises durant ces études on détermine « la dose sans effet observé »

4-Etudes de toxicité chronique

Dispositif expérimental

Animaux : espèce et nombre

Une ou plusieurs espèces, le rat est l’animal de choix. Chaque lot expérimental et le lot témoin comprennent un nombre identique de mâles et femelles(40à100).

Voie d’administration

La même utilisée dans les études précédentes.

Dose et durée

2 ans chez  le rat, chien et primates 7ans ou plus.

Dose choisis à la base des  études précédentes.

Examens

-Poids, consommation de nourriture, les observations générales, tests de laboratoire, examens post mortem.

Evaluation

            Objectif et définir  la nature de la toxicité et de déterminer la dose sans effet observé. Si la toxicité n’est pas trop grave par nature (exp : pas cancérogène) une dose journalière admissible (DJA) peut être extrapolée chez l’homme à partir des données animales.

            Un facteur de sécurité de 100 est recommandé : diviser le NOEL/100=dose journalière admissible, chez l’homme.

Etudes de toxicologie conventionnelle : essais de toxicité chez l’animal

1-Introduction

            Il est évident que les données toxicologiques de première importance sont celles déduites suite à une exposition humaine. Ceci permet d’éviter les difficultés rencontrées lors de la généralisation (extrapolation), à l’homme, des conclusions tirées à partir d’études sur les animaux( exemple du thalidomide).

            Cependant, les essais sur les animaux permettent de prédire l’innocuité/toxicité des substances et de définir des niveaux d’exposition acceptables pour l’homme. En fait, une part importante des connaissances sur la toxicité des xénobiotiques provient des études aux cours desquelles des animaux d’espèces variées reçoivent plusieurs doses d’un même toxique.

            Il existe trois catégories d’essais de toxicité qui diffèrent en fonction de la durée d’exposition : les essais de toxicité aiguë, les essais de toxicité sub-chronique (et/ou sub-aiguë) et les essais de toxicité chronique(à long terme).

2-Essais de toxicité aiguë 

            La plupart de ces études sont programmées pour déterminer la dose létale médiane(DL₅₀) du toxique,définie comme « l’estimation statistique d’une dose unique de produit supposée tuer 50% des animaux ».

            Ces études permettent de déterminer l’effet spécifique au produit, l’organe cible et de fournir des bases pour déterminer les doses à utiliser dans les études à long terme.

Dispositif expérimental pour la détermination de la DL₅₀

Sélection de l’espèce animal

-Ce sont généralement les rats et les souris qui sont sectionnées : disponibles à bon prix, obtention et manipulation facile, abondance des données toxicologiques qui facilitent la comparaison des toxicités.

-Une espèce autre qu’un rongeur est quelquefois nécessaire, lorsque les valeurs de la DL₅₀ sont très différentes entre les rats et les souris. Ou lorsque le schéma métabolique et différent de celui observé chez l’homme.

-La détermination est faite préférentiellement sur des animaux des deux sexes, jeunes et âgés.

Voie d’administration  

-Généralement, la même voie de l’exposition humaine. L’administration orale par gavage est la plus fréquente.

-Voie cutanée et respiratoire, pour les cas où l’exposition humaine est faite par ces voies, mais également en toxicologie professionnelle.

-La voie parentérale sert à tester la toxicité des médicaments parentériques.

Doses et nombre d’animaux  

-Pour déterminer correctement une DL₅₀ il est indispensable de sélectionner une dose qui tuera environ la moitié des animaux, une dose qui en tuera plus de la moitié(mais moins de 90%) et une dose qui en tuera moins de la moitié(mais de préférence plus de 10%). Quatre doses ou plus sont sélectionnées pour qu’au moins trois d’entre elles soient dans cette gamme.

-La précision de la DL₅₀ est améliorée en augmentant le nombre d’animaux par dose et en diminuant le rapport entre deux doses successives. La plupart des tests utilisent entre 40 à 50 animaux pour un test de mortalité et des rapports de 1,2 à 1,5.

Facteurs environnementaux

-Le conditionnement peu affecter la DL₅₀ : l’isoprotérenol a une DL₅₀ de moins de 50mg/kg chez des rats encages individuelles et d’environ 800mg/kg chez des rats par groupes de 10.

-Le type de cage (grillagée ou en plastique) et le matériau de litière peuvent aussi modifier la DL₅₀.

-La température peut modifier la toxicité : la toxicité de la strychnine, de la nicotine et de l’atropine est augmentée chez l’animal exposé au froid ; celle du malathion et du sarin(pesticide organophosphorés) est augmentée par la l’hypothermie, tandis que celle du parathion (autre organophosphoré) est réduite.

-L’augmentation de l’humidité relative peut être une cause d’augmentation de la toxicité aiguë, et donc de diminution de la DL₅₀.

Examens

-Après administration du toxique aux animaux, l’heure de la mort et le nombre de morts doivent être notés pour déterminer la DL₅₀.

-Il est important que les signes de toxicité soient aussi notés, exemple : pour l’appareil digestif ( nausée, diarrhées,…. ), pour plus de détailles voir le tableau( annexes) : relation entre organes(ou système) et signes cliniques d’intoxication.

-La période d’observation doit être suffisamment longue pour que les effets retardés- y compris la mort- ne passent pas inaperçus. Cette période est généralement de 7à14 jours, mais peut être plus longue.

-Des examens macroscopiques doivent être faits sur tous les animaux morts et au moins quelques survivants, particulièrement ceux qui présentent des signes de morbidité (pathologiques) à la fin des essais.

-L’autopsie est en mesure de fournir des informations utiles sur les organes cibles. Des examens histologiques d’organes sélectionnés peuvent compléter ces information.

Interprétation des données : Relation dose-réponse(effet)

Quand la mortalité est représentée graphiquement en fonction du logarithme de la dose, on obtient une courbe en S(sigmoïde).

Utilisation des DL₅₀ et des signes de toxicité

Ces données sont utilisables à plusieurs fins :

-Classification des produits chimiques selon leurs toxicités relatives(DL₅₀).

-Programmation des études subaiguë et chroniques sur les animaux.

3-Essais de toxicité subaigue (subchronique)

Dispositif expérimental pour la détermination de la DL₅₀

Sélection de l’espèce animal

-L’idéal serait que les espèces choisies biotransforment le toxique de la même façon que l’homme.

- Souvent le rat et le chien.

Espèces et nombre d’animaux  

-On utilise un nombre égale d’animaux de chaque sexe, pour chaque dose, pour le témoin généralement 10à30 rat. Ou un nombre plus réduit pour les chiens.

Voie d’administration

Doit refléter l’exposition humaine. Habituellement la voie orale.

Durée et doses

-Choisir 3 doses : une dose suffisamment élevée pour produire des signes de toxicité sans tuer tous les animaux. une dose faible sans effet toxique prévisible et une dose intermédiaire.

-Les doses sont sélectionnées sur la base  des résultats d’études de toxicité aiguë (DL₅₀ et la pente de la droite dose –réponse).

-La durée de ces études est en général de 90 jours chez le rat, et jusqu’à 6 mois ,voire 1 ou 2 ans chez le chien.

Examens

-Poids du corps et consommation alimentaire.

-Observation générale : concerne l’aspect, le comportement, et toutes les anomalies visibles. Les animaux morts ou moribonds (mourants) sont soumis à des examens macroscopiques et microscopiques.

-Examens de laboratoire : hématologiques, biochimiques, chimies des urines,…

-Examens post mortem(après la mort) : tous les animaux morts ou mourant soumis à des autopsies, examens histologiques, poids des différents organes.

Evaluation

Sur la base des données obtenues lors des différents examens réalises durant ces études on détermine « la dose sans effet observé »

4-Etudes de toxicité chronique

Dispositif expérimental

Animaux : espèce et nombre

Une ou plusieurs espèces, le rat est l’animal de choix. Chaque lot expérimental et le lot témoin comprennent un nombre identique de mâles et femelles(40à100).

Voie d’administration

La même utilisée dans les études précédentes.

Dose et durée

2 ans chez  le rat, chien et primates 7ans ou plus.

Dose choisis à la base des  études précédentes.

Examens

-Poids, consommation de nourriture, les observations générales, tests de laboratoire, examens post mortem.

Evaluation

            Objectif et définir  la nature de la toxicité et de déterminer la dose sans effet observé. Si la toxicité n’est pas trop grave par nature (exp : pas cancérogène) une dose journalière admissible (DJA) peut être extrapolée chez l’homme à partir des données animales.

            Un facteur de sécurité de 100 est recommandé : diviser le NOEL/100=dose journalière admissible, chez l’homme.

Legionellaceae

Caractères bactériologiques :

• Bacilles à Gram négatif

• non sporulés, non capsulés,

• non acidorésistants,

• mobiles (1 ou 2 flagelles polaires),

• Aérobies strictes,

• 0,3 à 0,9 µm de large sur 2 à 20 µm de long 

• 1 genre de 53 espèces et 70 sérogroupes

• L. pneumophila

Classification:

• Règne                                    Bacteria

• Division                                  Proteobacteria

• Classe                                   Gamma Proteobacteria

• Ordre                                     Legionellales

• Famille                                   Legionellaceae

• Ordre                                     Legionella

Habitat:

Bactérie ubiquiste, non commensale, à développement intracellulaire facultatif.

Habitat naturel :  hydrotellurique (eau et sols).

•eaux douces (lacs, rivières, eaux stagnantes…)

•terre humide et composts.

•Elle se multiplie dans des protozoaires libres (amibes) (symbiose)

Réservoirs artificiels :

• Réseaux d’eau chaude, collectivités +++ (hôpitaux, hôtels, immeubles)

• Systèmes de climatisation « humides » : caissons d’humidification,

aérocondenseurs, tours aéro-réfrigérantes.

• Autres sources retrouvées : thermes, saunas, bains à remous, machines à glace, brumisateurs, fontaines …

Legionella pneumophila : espèce type

Généralités :

• Responsable de plus de 95 % de cas de legionellose (maladie des légionnaires) .

• Pneumonies communautaires et nosocomiales

• L. pneumophila sérogroupe 1 est associé à plus de 80 % des cas.

• Pneumopathies graves  au centre « 58è congrès de l’American Legion » , aux Etats-Unis en 1976.

•18 janvier 1977 Mac Dade et coll. isolent une bactérie à Gram - de poumons de 4 sujets décédés

 Caractères bactériologiques:

Morphologie:

bacilles a Gram -, non sporulées, non capsulées, mesurent de 0,3 a 0,9 μm de largeur sur 1,5 a 5 μm de longueur.

 

Caractères culturaux:

•Aérobie stricte  CO2 (2.5%)

•PH 6.85-6.95 tolère pH 5.5

•T°= 35°C/ 3 -10 jours

•Exigence en cystéine et fer

• « - »sur gélose au sang

•gélose BYCE (Buffered Charcoal Yeast Extract) supplémentée en L-cystéine, en tampon ACES et en fer. 

Après 5 à 7 jours:

Colonies de 3 à 4 mm. grisâtres, de consistance muqueuse, de taille hétérogène et, observées à la loupe binoculaire, elles ont généralement un aspect en verre brisé.

Caractères biochimiques:

•L'oxydase est généralement négative ou faiblement positive.

•Glucose - , nitrates - , urease-, catalase +, gelatinase-positives.

Pouvoir pathogène:

•Maladie des légionnaires

–incubation de 2 à 10 jours

–début progressif

–état : syndrome infectieux intense (pneumopathie très fébrile extensive associée à des manifestations extra pulmonaires (diarrhée)

•La fièvre de Pontiac

–atteinte bénigne des voies aériennes supérieures

due à une souche particulière de L. pneumophila 1

–incubation courte (36 heures)

–guérison spontanée

•légionelloses des immunodéprimés

–transplantés, cancer bronchique, leucémies …

–taux de létalité élevé

Les facteurs de risque:

•Homme

•plus de 50 ans

•fumeur

•éthylique

•affection cardio-pulmonaire chronique

•insuffisance rénale chronique

•diabète

Facteurs de pathogénicité :

• Capacité à se multiplier dans les monocytes, les macrophages alvéolaires et les cellules épithéliales alvéolaires de type I et II           

               destruction de ces cellules.

• pili de type IV

§ Cellules infectées

Ø faible nombre de bactéries              mort par apoptose.

Ø Grand nombre de bactéries             mort par nécrose.

La transmission:

•Transmission aérienne par inhalation d ’eau contaminée diffusée en aérosol

•pas de transmission inter humaine

•ingestion  ?

Diagnostic bactériologique

Méthodes de diagnostic                        Sensibilité                    Spécificité

• Immunofluorescence directe                         25                                       65

• Mise en culture du prélèvement                    62                                      100

• Recherche d’antigènes urinaires                55-80                                     99

• Sérologie                                                    10-75                                   95-99

• Amplification de gènes spécifiques               ?                                            ?

     Sensibilité aux antibiotiques et traitement

•Bêta-lactamines:

–résistance par secretion de bêta –lactamase

•Macrolides: Erythromycine voie orale pour les formes communes en monothérapie

•Fluoroquinolones: voie orale pour les formes communes

•Traitement formes sévères: association avec rifampicine voie parentérale

                      

Mesures de prévention:

•PAS d’antibioprophylaxie pour les personnes ayant été exposées à des aérosols contaminés.

• surveillance environnementale et clinique qui nécessite :

•programme d'entretien régulier des réseaux (nettoyage pour éliminer le tartre),

•une circulation permanente de l'eau avec élimination des bras morts et        une température suffisante de l'eau (60°C au site de production et 50°C aux points d'usage).

L’objectif cible dans les établissements de santé est de maintenir la concentration en légionelles < 103 UFC / litre d’eau.